*원문링크 science.org/doi/10.1126/science.adp5637*Abstract Enzymes capable of breaking down polymers have been identified from natural sources and developedfor industrial use in plastic recycling. However, there are many potential starting points for enzymeoptimization that remain unexplored. We generated a landscape of 170 lineages of 1894 polyethyleneterephthalate depolymerase (PETase) candidates and performed profiling using sampling approacheswith features associated with PET-degrading capabilities. We identified three promising yet unexploredPETase lineages and two potent PETases, Mipa-P and Kubu-P. An engineered variant of Kubu-Poutperformed benchmarks in terms of PET depolymerization in harsh environments, such as thosewith high substrate load and ethylene glycol as the solvent.

원문링크: https://www.nature.com/articles/s44286-024-00063-zAbstractDecarbonizing the steel industry, a major CO2 emitter, is crucial for achieving carbon neutrality. Escaping the grip of CO combustion methods, a key contributor to CO2 discharge, is a seemingly simple yet formidable challenge on the path to industry-wide net-zero carbon emissions. Here we suggest enzymatic CO hydration (enCOH) inspired by the biological Wood‒Ljungdahl pathway, enabling efficient CO2 fixation. By employing the highly efficient, inhibitor-robust CO dehydrogenase (ChCODH2) and formate dehydrogenase (MeFDH1), we achieved spontaneous enCOH to convert industrial off-gases into formate with 100% selectivity. This process operates seamlessly under mild conditions (room temperature, neutral pH), regardless of the CO/CO2 ratio. Notably, the direct utilization of flue gas without pretreatment yielded various formate salts, including ammonium formate, at concentrations nearing two molar. Operating a 10-liter-scale immobilized enzyme reactor feeding live off-gas at a steel mill resulted in the production of high-purity formate powder after facile purification, thus demonstrating the potential for decarbonizing the steel industry.

원문링크: https://www.nature.com/articles/s41467-024-46909-1AbstractFe‒S cluster-harboring enzymes, such as carbon monoxide dehydrogenases (CODH), employ sophisticated artificial electron mediators like viologens to serve as potent biocatalysts capable of cleaning-up industrial off-gases at stunning reaction rates. Unraveling the interplay between these enzymes and their associated mediators is essential for improving the efficiency of CODHs. Here we show the electron mediator-interaction site on ChCODHs (Ch, Carboxydothermus hydrogenoformans) using a systematic approach that leverages the viologen-reactive characteristics of superficial aromatic residues. By enhancing mediator-interaction (R57G/N59L) near the D-cluster, the strategically tailored variants exhibit a ten-fold increase in ethyl viologen affinity relative to the wild-type without sacrificing the turn-over rate (kcat). Viologen-complexed structures reveal the pivotal positions of surface phenylalanine residues, serving as external conduits for the D-cluster to/from viologen. One variant (R57G/N59L/A559W) can treat a broad spectrum of waste gases (from steel-process and plastic-gasification) containing O2. Decoding mediator interactions will facilitate the development of industrially high-efficient biocatalysts encompassing gas-utilizing enzymes.

The 2023 Enzyme Engineering Award is given to Professor Hak-Sung Kim of the Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Prof. Kim is honored with this award for his sustained groundbreaking research in the field of enzyme technology with a focus on the design of new biocatalysts, development of tools for advancing enzyme engineering, a role of conformational dynamics of enzyme, and integrating biocatalysis with metabolic engineering. His work has led to commercial processes among a large number of innovations, and he has been a leading figure in Korea, across Asia and in the worldwide enzyme technology/biocatalysis community in driving new discoveries and technologies.원문링크:https://eci.informz.net/informzdataservice/onlineversion/ind/bWFpbGluZ2luc3RhbmNlaWQ9MTExODMzNzEmc3Vic2NyaWJlcmlkPTEwMDIzNzc1NjA=

원문링크: https://www.nature.com/articles/s41929-022-00834-yAbstractNi–Fe carbon monoxide dehydrogenases (CODHs) are nearly diffusion-limited biocatalysts that oxidize CO. Their O2 sensitivity, however, is a major drawback for industrial applications. Here we compare the structures of a fast CODH with a high O2 sensitivity (ChCODH-II) and a slower CODH with a lower O2 sensitivity (ChCODH-IV) (Ch, Carboxydothermus hydrogenoformans). Some variants obtained by simple point mutations of the bottleneck residue (A559) in the gas tunnel showed 61–148-fold decreases in O2 sensitivity while maintaining high turnover rates. The variant structure A559W showed obstruction of one gas tunnel, and molecular dynamics supported the locked position of the mutated side chain in the tunnel. The variant was exposed to different gas mixtures, from simple synthetic gas to sophisticated real flue from a steel mill. Its catalytic properties remained unchanged, even at high O2 levels, and the efficiency was maintained for multiple cycles of CO detoxification/regeneration.

[원문링크]: https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/gc/d1gc04113dAbstractC18 trihydroxy fatty acids (THFAs), plant oxylipins, are used as antifungal agents and vaccine adjuvants. The chemical synthesis of THFAs has several disadvantages, including low yields and environmental pollution. Microorganisms and plants also produce THFAs in vivo; however, the productivity is low. Here, we reported a recombinant Escherichia coli co-expressing bacterial linoleic acid (LA) 13-lipoxygenase with high isomerization activity and epoxide hydrolase that converted 200 mM polyunsaturated fatty acids, including LA, α-linolenic acid, and γ-linolenic acid (GLA), into THFAs via epoxy hydroxy fatty acids with high conversion yields (%26gt;60%) in a flask. Among the products, GLA-derived 12S,13S-epoxy-11R-hydroxyoctadecadienoic acid and 11R,12R,13S-trihydroxyoctadecadienoic acid were new compounds. For the efficient biotransformation of safflower oil into THFA, the LA content in the safflower oil hydrolyzate was increased by the addition of an adsorbent resin with lipase to safflower oil. The resin bound unsaturated fatty acids, thereby removing unbound impurities such as palmitic acid and glycerol. In a 3 L-bioreactor, the recombinant cells converted 250 mM (70 g L−1) LA in resin-treated safflower oil hydrolyzate, which was derived from safflower oil (93 g L−1), into 230 mM (76 g L−1) 11R,12R,13S-trihydroxyoctadecenoic acid in 24 h, with a conversion yield of 92% and a productivity of 9.6 mM h−1. The product was isolated with a purity of 94% and an isolated yield of 75%. We successfully developed an efficient, cost-effective, and eco-friendly process for the biotransformation of safflower oil into THFAs.

[원문링크]: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05410AbstractHighly enantioselective lipase has been widely utilized in the preparation of versatile enantiopure chiral sec-alcohols through kinetic or dynamic kinetic resolution. Lipase is intrinsically (R)-selective, and it is difficult to obtain (S)-selective lipase. Recent crystal structures of a family VIII carboxylesterase have revealed that the spatial array of its catalytic triad is the mirror image of that of lipase but with a catalytic triad that is distinct from lipase. We, therefore, hypothesized that the family VIII carboxylesterase may exhibit (S)-enantioselectivity toward sec-alcohols similar to (S)-selective serine protease, whose catalytic triad is also spatially arrayed as its mirror image. In this study, a homologous enzyme (carboxylesterase from Proteobacteria bacterium SG_bin9, PBE) of a known family VIII carboxylesterase (pdb code: 4IVK) was prepared, which showed not only moderate (S)-selectivity toward sec-alcohols such as 3-butyn-2-ol and 1-phenylethyl alcohol but also (R)-selectivity toward particular sec-alcohols among the substrates explored. Furthermore, the (S)-selectivity of PBE has been significantly improved by rational redesign based on molecular modeling. Molecular modeling identified a binding pocket composed of Ser381, Ala383, and Arg408 for the methyl substituent of (R)-1-phenylethyl acetate and suggested that larger residues may increase the enantioselectivity by interfering with the binding of the slow-reacting enantiomer. As predicted, substituting Ser381with larger residues (Phe, Tyr, and Trp) significantly improved the (S)-selectivity of PBE toward all sec-alcohols explored, even the substrates toward which the wild-type PBE exhibits (R)-selectivity. For instance, the enantioselectivity toward 3-butyn-2-ol and 1-phenylethyl alcohol was improved from E = 5.5 and 36.1 to E = 2001 and 882, respectively, by single mutagenesis (S381F).

원문링크: https://m.ibric.org/trend/news/subread.php?Board=news%26amp;id=336450%26amp;rtpath=dmailKAIST는 생명과학과 김학성 교수와 배진호 박사팀이 거대 (초분자) 단백질을 레고 블록 쌓듯 조립할 수 있는 새로운 기술을 개발했다고 19일 밝혔다. 이 방법으로 단백질 구조체의 크기 및 작용기 수를 원하는 대로 조절할 수 있고 메가 달톤(dalton) 크기의 대칭형 거대 단백질 구조체를 조립할 수 있다. 거대 단백질 구조체는 효율적인 약물 전달, 다양한 백신 개발, 그리고 질병 진단에 활용될 것으로 기대된다.이번 연구 성과는 국제 저명 학술지인 `어드밴스드 사이언스(Advanced Science) (IF: 16.806)에 2021년 11월 1일 字 온라인 발표됐다. (논문명: Dendrimer-like supramolecular assembly of proteins with a tunable size and valency through stepwise iterative growth)자연계에는 매우 다양한 특성과 기능을 갖는 단백질이 존재하며 생명현상을 유지하는데 핵심 역할을 한다. 이러한 단백질 중에는 단량체가 큰 구조체 형태로 조립됐을 때만 정상적 기능을 수행하거나, 어떤 경우에는 조립된 경우가 단량체와 완전히 다른 특성을 나타내며, 심지어는 심각한 질병을 유발하는 경우도 많다.예를 들어 바이러스의 껍질인 켑시드는 단백질 단량체가 조립(assembly)된 것이고, 치매는 아밀로이드 펩타이드나 타우(tau) 단백질이 파이브릴(fibril) 형태로 조립되면서 발생한다. 따라서, 거대(초분자) 단백질 구조체들의 조립 기작 이해는 단백질의 기능과 질병의 원인 규명 및 치료제 개발에 중요하다. 또한, 단백질 구조체는 뛰어난 생체 적합도 때문에 생명공학 및 의학 분야에서도 응용 가능성이 크다.현재 많은 연구 그룹에서 자연계에 존재하는 단백질 구조체들의 조립 과정을 모방해 새로운 기능의 단백질 구조체 개발에 많은 연구를 진행하고 있다. 그러나 단백질의 구조적 다양성, 상이한 특성 및 큰 분자량 때문에 원하는 구조체를 자유자재로 조립하는 것은 아직도 어려운 과제로 남아 있다.김학성 교수 연구팀은 두 종류의 빌딩(building) 블록 단백질을 코어(core) 단백질에 순차적으로 교대로 결합시킴으로써 간편하게 3차원 구조의 대칭형 거대 단백질 구조체를 조립하는 방법을 개발했다. 즉, 서로 특이적으로 반응하는 두 쌍의 단백질과 리건드(P1/L1 과 P2/L2)를 이용해 코어(core) 단백질에 두 종류의 빌딩(building) 블록을 순차적, 반복적으로 결합함으로써 크기와 작용 기작 수를 조절하면서 메가 달톤 (Mega Dalton) 크기를 갖는 단백질 구조체를 쉽게 조립하였다.개발된 구조체는 다양한 분야에 응용 가능하며 하나의 예로서, 이번 연구에서는 단백질 구조체에 박테리아 독소를 결합해 암세포 내로 고효율로 전달할 수 있었고, 결과적으로 암세포를 효과적으로 사멸했다. 구조체 단백질의 특징인 다가 효과(avidity effect)로 인해 암 표적에 대한 결합력이 약 1,000배 이상 증가돼 암세포 사멸 효과가 획기적으로 증대됐고 이러한 특성은 백신 개발 및 질병 진단에도 응용될 수 있다.제1 저자인 배진호 박사는 "이번 연구에서 개발된 거대(초분자) 단백질 구조체 조립 기술은 향후, 약물 전달, 백신 개발, 질병 진단 및 바이오센서 등을 포함한 광범위한 분야에서 새로운 플랫폼 기술로 활용될 수 있을 것ˮ이라고 말했다.이번 연구는 한국 연구 재단의 중견 연구과제 (NRF-2021R1A2C201421811) 지원을 받아 수행됐다.논문링크: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202102991□ 연구개요1. 연구 배경자연계에는 매우 다양한 특성과 기능을 갖는 단백질이 존재하며 생명현상을 유지하는데 핵심 역할을 한다. 이러한 단백질 중에는 단량체가 큰 구조체로 조립 되었을 때만 정상적 기능을 수행하거나, 단량체와는 완전히 다른 특성을 나타내기도 하며, 심각한 질병을 유발하는 경우도 많다. 따라서, 거대 (초 분자) 단백질 구조체들의 조립 기작 이해는 단백질의 기능과 질병의 원인 규명 및 치료제 개발에 중요하다. 또한, 단백질 구조체는 뛰어난 생체 적합도 때문에 생명공학 및 의학분야에서도 응용 가능성이 높다. 현재 많은 연구 그룹에서 자연계에 존재하는 단백질 구조체들의 조립 과정을 모방하여 새로운 기능의 단백질 구조체 개발에 많은 연구를 진행하고 있다. 주로 나선형 번들 (bundle) 상호 작용, 펩타이드 리간드 상호 작용, 이황화 결합 형성, 화학적 결합, 금속 이온 상호 작용, 자기 결합 단백질 융합과 컴퓨터 설계를 통한 방법 등이 시도되었다. 그러나, 단백질의 구조적 다양성, 상이한 특성 및 큰 분자량 때문에 원하는 구조체를 자유자재로 조립하는 것은 아직도 어려운 과제로 남아 있다.2. 연구 내용두 종류의 building 블록 단백질을 core 단백질에 순차적으로 교대로 결합시킴으로써 간편하게 3 차원 구조의 대칭형 거대 단백질 구조체를 조립할 수 있는 방법을 개발하였다. 즉, 서로 특이적으로 반응하는 두 쌍의 단백질과 리건드 (P1/L1 과 P2/L2)를 이용하여 core 단백질에 두 종류의 building 블록을 순차적, 반복적으로 결합시킴으로써 크기와 작용 기작 수를 조절하면서 메가 Dalton 크기를 갖는 단백질 구조체를 용이하게 조립할 수 있다. 구체적으로, 크기가 27 kDa인 작은 core 단백질로부터 시작하여 총 4번의 조립 단계를 거쳐 최종적으로 959 kDa의 크기를 갖는 거대 단백질 구조체를 제작하였으며 조립 단계를 증가시키면 보다 큰 단백질 구조체의 제작이 가능하다. 또한, 각 조립 단계마다 단백질 구조체의 결합가가 2의 배수로 증가하여 구조체의 결합가(Valency) 개수를 쉽게 조절할 수 있고, 다양한 단백질을 용이하게 결합시킬 수 있다.암 표적인 표피생장인자수용체 (EGFR)에 특이적인 단백질을 단백질 구조체에 결합한 경우, 구조체 단백질의 특징인 다가 효과 (avidity effect)로 인해 EGFR에 대한 결합력이 단량체 보다 무려 1,000배 이상 증가하였다. 이러한 결합력 증대를 통한 효율적 세포 내 단백질 전달을 위해 박테리아 독소 전달 도메인 (translocation domain)과 녹색형광단백질 및 식물 유래 독소 단백질인 ‘젤로닌’을 구조체에 결합한 경우 세포 내 단백질 전달이 크게 증대되었으며 이로 인한 획기적 암 세포 사멸 효과를 확인 하였다.3. 기대 효과개발된 거대 단백질 구조체 조립 방법은 자연계에 존재하는 다양한 구조체들의 조립 및 작용 기작을 이해하는데 기여할 것이다. 또한, 단백질 구조체는 크기와 avidity effect를 용이하게 조절할 수 있고 다양한 단백질 cargo로 기능화할 수 있으며 생체 적합도가 높은 단백질로만 구성되어 있다. 따라서, 거대 단백질 구조체 조립 기술은 향후, 약물 전달, 백신 개발, 질병 진단 및 바이오센서 등을 포함한 광범위한 분야에서 플랫폼 기술로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

원문링크: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389421010396연구 배경 PET의 생물학적 분해는 선택적으로 플라스틱 폐기물 문제를 해결할 수 있는 친환경적이며 지속가능한 방법으로 각광받고 있다. 특히 PET 분해효소를 분비하는 미생물은 환경에 유리된 플라스틱 폐기물 처리에 유용하게 활용될 수 있어 Ideonella sakaiensis 유래 PETase (IsPETase)에 대한 광범위한 연구가 수행되었다. 효율적인 PET 분해효소 개발 및 산업적 활용을 위해서는 IsPETase의 분자수준에서의 PET 분해 메커니즘에 대한 명확한 이해가 필요하다.연구 성과 IsPETase와 같은 Type IIb에 속하며 72% 유사도를 보이는 Rhizobacter gummiphilus NS21 균주 유래 PETase (RgPETase) 단백질에 대한 연구를 통해 PET 분해 메커니즘에 대한 이해를 높이고자 하였다. RgPETase는 microcrystalline PET에 대해서는 IsPETase와 유사한 가수분해 활성을 가지지만 amorphous PET 필름에 대해서는 전혀 다른 활성을 보였다. RgPETase의 구조 분석은 효소가 IsPETase의 주요한 구조적 특징을 공유하고 있으나 Wobbling tryptophan을 포함한 루프의 모양 및 표면 전하에서 차이가 있다는 것을 보여주었다. 더 나아가 RgPETase 단백질 표면의 정전기 전하가 PET 분해능에 미치는 영향을 규명하며 PET 분해 메커니즘에 대한 이해를 높였다.향후 계획 중온에서 IsPETase와 유사한 PET 분해능을 보이는 RgPETase는 산업적으로 활용가능한 효율적인 PET 분해효소의 새로운 타겟 단백질로 활용될 수 있으므로, 효소의 PET 분해능 및 열안정성을 높이기 위한 단백질 공학연구를 수행할 예정이다. 또한, 다양한 기질에 대한 분해능 측정을 통해 PET 분해효소가 PET 표면에 비특이적으로 결합하는 흡착 메커니즘을 규명하기 위한 연구를 진행할 계획이다.AbstractThe development of a superb polyethylene terephthalate (PET) hydrolyzing enzyme requires an accurate understanding of the PET decomposition mechanism. However, studies on PET degrading enzymes, including the PET hydrolase from Ideonella sakaiensis (IsPETase), have not provided sufficient knowledge of the molecular mechanisms for the hardly accessible substrate. Here, we report a novel PET hydrolase from Rhizobacter gummiphilus (RgPETase), which has a hydrolyzing activity similar to IsPETase toward microcrystalline PET but distinct behavior toward low crystallinity PET film. Structural analysis of RgPETase reveals that the enzyme shares the key structural features of IsPETase for high PET hydrolysis activity but has distinguished structures at the surface-exposed regions. RgPETase shows a unique conformation of the wobbling tryptophan containing loop (WW-loop) and change of the electrostatic surface charge on the loop dramatically affects the PET-degrading activity. We further show that effect of the electrostatic surface charge to the activity varies depending on locations. This work provides valuable information underlying the uncovered PET decomposition mechanism.