원문링크: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c01348
연구 배경
베타-히드록시-알파-아미노산은 항생제, 항암제의 원료로 이용되는 고부가가치 물질로서, 지난 30년 동안 합성법이 연구되어 왔지만, 현재까지의 화학적, 생물학적 합성 방법으로는 고순도 (입체특이적) 및 대량 합성에 도달하지 못하고 있다. 트레오닌 합성효소는 베타-히드록시-알파-아미노산을 합성하는 효소로, 글리신과 알데히드의 탄소 간 결합을 형성하는 효소이다. 하지만, 탄소 간의 중합으로 형성되는 베타-탄소 부위에서 이성질체를 구분하는 입체특이성이 낮고, 기존에 보고된 효소들의 활성도 낮아 산업적 이용이 어려운 문제점이 있어왔다.
연구 성과
트레오닌 합성효소는 다양한 알데히드를 이용할 수 있는 넓은 기질특이성을 가지지만, 트레오닌 합성의 기질인 아세트알데히드에는 입체특이성과 활성이 낮다는 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해, 기존에 구조와 효소 특성이 잘 알려져 있는 Alcaligenes xylosoxidans 유래의 D-트레오닌 합성효소 (AxDTA) 서열과 서열상동성이 낮은 잠정적인 D-트레오닌 합성효소 서열들을 확보하였다. 확보한 서열들을 발현하고, 효소 활성과 입체특이성을 확인한 결과, AxDTA 에 비해 효소활성은 20배 높고, 입체특이성은 향상된 Filomicrobium marinum 유래의 DTA (FmDTA) 를 확보할 수 있었다.
하지만, 여전히 낮은 입체특이성 문제로 산업적 이용에 적합하지 않았다. 해당 공동연구팀은 FmDTA 의 crystal structure 를 규명하고, rational design 을 통해 효소의 활성부위에서 D-트레오닌의 입체특이성에 관련될 것으로 추정되는 잔기들을 선별하였다. 해당 잔기들의 돌연변이 연구 결과, 99.9 % 의 순도로 D-트레오닌을 합성하는 효소를 확보하였다. 그리고, 추가적인 돌연변이 연구로 합성 반응에 대한 새로운 추정된 메커니즘을 제시하였다.
한편, D-트레오닌 합성효소는 가역반응이 가능하기 때문에, 장시간 반응에서 입체특이성이 감소한다고 보고되어 있다. 이는 산업적 적용에 있어서의 또 다른 문제점이지만, 해당 연구로 개량된 효소는 장시간 반응에도 입체특이성에 큰 변화가 없었다. 이는 해당 돌연변이 효소가 생산 공정의 적용에 상당한 이점을 가진다는 것을 암시한다.
D-트레오닌 합성효소는 다양한 알데히드를 이용하여, 폭넓은 베타-히드록시-알파-아미노산을 합성할 수 있는 장점이 있다. FmDTA 도 아세트알데히드 외에 다른 알데히드를 기질로 이용하여, 여러 생성물을 합성함을 확인하였다. 또한, 해당 연구에서 확보한 돌연변이 효소는 다른 생성물에 대해서도 입체특이성을 향상시키는 결과를 보여주었다. 이러한 연구 결과들은 향후 다양한 베타-히드록시-알파-아미노산의 고순도 및 대량 합성에 적용할 수 있음을 암시한다.
향후 계획
D-트레오닌의 합성에 이용되는 기질인 아세트알데히드는 실온 부근의 낮은 끓는점과 불안정성의 특징을 가지고 있기 때문에, 이를 안정화시키는 것이 중요하다. 해당 연구진은 확보한 개량 효소를 소형 발효조에서 반응시켜 6시간 반응 만에 50 g/L 이상의 D-트레오닌이 97% 이상의 순도로 생성되는 것을 확인하였다. 개발된 기술은 ㈜엠에이치투바이오케미칼에 기술이전하여 신제품 개발을 추진중이다. 현재, 발현 시스템 개선 및 효소 대량 확보와 다양한 베타-히드록시-알파-아미노산 생산을 목적으로 연구를 진행중이며, 이는 반응 공정의 효율성, 생산성 크게 향상시키고, 제품의 다양화를 가능하게 할 것으로 예상된다.
abstract
D-Threonine aldolase (DTA) is a useful biocatalyst that reversibly converts glycine and aldehyde to β-hydroxy-α-D-amino acid. However, low activity and poor diastereoselectivity limit its applications. Here we report DTA from Filomicrobium marinum (FmDTA) that shows much higher activity and Cβ-stereoselectivity in D-threonine production compared with those of other known DTAs. We determine the FmDTA structure at a 2.2 Å resolution and propose a DTA catalytic mechanism with a kernel of the Lys49 inner proton sink and metal ion in the aldol reaction cycle. The enzyme is rationally engineered to have high Cβ-stereoselectivity based on spatial constraint at the anti-specific aldehyde position in the mechanism, and the rational strategy is further applied to other DTAs for syn-production. The final FmDTAG179A/S312A variant exhibits a near-perfect 99.5% de value for D-threonine and maintains the de value above 93% even under kinetically unfavorable conditions. This study demonstrates how a detailed understanding of the reaction mechanism can be used for rational protein engineering.